Государственное
санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации
Государственные санитарно-эпидемиологические
правила и гигиенические нормативы
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита
в воздухе рабочей зоны
Методические указания
МУК 4.2.1782-03
МИНЗДРАВ РОССИИ
МОСКВА 2004
Методические указания. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.
1. Разработаны: Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).
2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.
3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.
4. Введены впервые.
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации,
Первый заместитель Министра
здравоохранения Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
24 октября 2003 г.
Дата введения: 1 декабря 2003 г.
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения концентрации
клеток микроорганизма Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита
в воздухе рабочей зоны
Методические указания
МУК 4.2.1782-03
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».
2. Биологическая характеристика Candida tropicalis Y-456 и его гигиенический норматив
На сусло-агаре на 2 - 3 сутки штамм образует круглые кремоватые колонии с ровным краем, средний диаметр изолированных колоний составляет 0,3 см, а максимальный - 0,8 см. В центре колоний образуется небольшое возвышение - «бугорок», на среде появляется маленькое желто-оранжевое окрашивание. Консистенция колоний мягкая, неплотная, вязкая. Поверхность гладкая, слегка матовая.
Морфологически штамм представлен полиморфными клетками: округлые, овальные, большей частью одиночные 2 - 4 мкм, иногда цепочки или конгломераты из вытянутых клеток 10 - 12 мкм. Наблюдается обилие бластоспор.
При выращивании на кукурузном агаре по Дальмау в чашках Петри обильно образуются с многократными разветвлениями и бластоконидиями, расположенными одиночно или цепочками вдоль гиф (7).
Систематическое положение микроорганизма.
Класс Fungi imperfecti
Порядок Blastomycetales
Род Candida
Вид tropicalis
Штамм Y-456
Штамм получен из ЦМПМ ВНИИгенетика как продуцент этанола и селектирован по признаку формирования крупных колоний на средах с ксилозой. Штамм является продуцентом ксилита. Продуктивность на средах с 5 % содержанием ксилозы: максимальная - 80 % ксилита, средняя - 78,8 - 76,2 % (39,5 г/л) ксилита.
Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Оптимальная температура роста 35 - 37 °С, рН среды - 5,0 - 6,0. Для размножения используется сусло-агар 5 - 6 °Б, среда ДАП - глюкоза (ксилоза) - 20 г, дрожжевой экстракт - 2,0 г, пептон - 2 г, агар-агар - 20 г, вода - 1 л, рН среды - 5,0 - 6,0.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 300 кл./м3, пометка А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на 2 сутки. В качестве дополнительного контроля предлагается отбор пробы на чашку Петри с селективной средой для дифференцирования С. tropicalis от других дрожжеподобных грибов, обладающих способностью к образованию ростковых трубок (8, 9).
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа
воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные
или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с увеличением ´ 10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические
плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм
Пробирки биологические, вместимостью
20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Среда сусло-агар: солодовое сусло (значение
Баллинга от 5 до 6°) - 98 %, агар-агар - 2 %,
рН среды 5,0 - 6,0, режим стерилизации
1,1 - 1,2 ати, 40 мин
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Антибиотик биомицин (хлортетрациклина
гидрохлорид)
Сыворотка или плазма крови человека
(вместо них можно использовать среду 199)
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.
6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность среды сусло-агар. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 2 сутки после посева проб воздуха по культурально-морфологическим признакам. Метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, добавляют антибиотик биомицин из расчета 100 мг/л (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.
Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 37 °С. Через 2 суток производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
Для постановки дополнительного контроля в среду добавляют сыворотку или плазму крови человека (можно также заменить средой 199) из расчета 0,5 мл сыворотки на 5 мл среды. После отбора проб инкубируют при 37 °С в течение 3 часов. При микроскопировании некоторые дрожжеподобные грибы (С. albicans) в отличие от С. tropicalis на селективной среде образуют ростковые трубки диаметром 3 - 4 мкм и длиной до 20 мкм (они сходны с мицелием, но не дают сужения в месте прикрепления к дрожжевой клетке).
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:
кл./м3, где
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Candida tropicalis Y-456
в воздухе рабочей зоны
|
1. Дата проведения анализа ___________________________________________________ |
|
2. Место отбора пробы _______________________________________________________ |
|
3. Название лаборатории _____________________________________________________ |
|
4. Юридический адрес организации ____________________________________________ |
Результаты микробиологического анализа
|
Шифр или № пробы |
Определяемый микроорганизм |
Концентрация, кл./м3 |
|
|
|
|
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».
2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ «Методики выполнения измерений».
3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. - М., 1980. 27 с.
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. - М., 1977. 7 с.
5. Влодавец В.В., Немыря В.И. Санитарно-микологический контроль объектов окружающей среды на предприятиях микробиологической промышленности // Гиг. и сан., 1977. № 1. С. 25 - 28.
6. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. - М.: МГУ. С. 332.
7. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. - М.: Мир, 2001. 110 с.
8. Кашкин П.Н., Лисин В.В. Практическое руководство по медицинской микологии. - М.: Медицина, 1983. 153 с.
9. Kwon-Chung K.J., Bennett J.E. Medical mycology. Philadelphia: Lea & Febiger, 1992. P. 61 - 62.
СОДЕРЖАНИЕ